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產(chǎn)品類別：骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離
 
產(chǎn)品編號(hào)：VE2012PAPG
 
產(chǎn)品名稱：熊貓骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞分離液試劑盒
 
產(chǎn)品規(guī)格：2X200ml/Kit
 
產(chǎn)品價(jià)格：￥1150.00元
 
本品用于分離熊貓骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞


 
“XXXX”動(dòng)物骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法
 
 
技術(shù)文檔編號(hào)：TBD0045SOP
 
【產(chǎn)品規(guī)格】
 
2×200ml/Kit
 
【產(chǎn)品組成】
 
為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：
 

	名稱	產(chǎn)品編號(hào)	規(guī)格
A	分離液 1		200ml
B	分離液 2		200ml
C	樣本稀釋液（贈(zèng)品）	2010C1119	200ml
D	清洗液（贈(zèng)品）	2010X1118	200ml
E	F 液（贈(zèng)品）	F2013TBD	200ml
F	說(shuō)明書		1 份

 
【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
 
適用儀器：最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
 
【檢驗(yàn)方法】
 
全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
 

• 首先制備骨髓單細(xì)胞懸液，制備方法詳見“骨髓沖洗單細(xì)胞懸液制備技術(shù)（文檔編號(hào)：

 
TBD0004SOP）”。
 

• 取一支離心管，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:1，試劑總量與細(xì)胞懸液體積比為 2：1。如細(xì)胞懸液為 2ml，則先后加入分離液 1：3ml、分離液 2：1ml。試劑總量最少不低于 4ml。），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。

 

• 用吸管小心吸取細(xì)胞懸液加于分離液液面上，500g，離心 20-30min（注：根據(jù)樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到最佳分離效果）。

 

• 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為六層。第一層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色內(nèi)皮祖細(xì)胞層（第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層（下層 50%分離液 2 及第二層白環(huán)）。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì)胞層。第六層為紅細(xì)胞層。

• 用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。

 

• 250g，離心 10min。

 

• 棄上清。

 

• 用吸管以 5-10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

 

• 250g，離心 10min。

 

• 重復(fù) 7、8、9，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

 
分離圖例：
 
 
 
 
【差異貼壁法純化細(xì)胞】
 
（1）用內(nèi)皮祖細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào)：TBD20180012）或內(nèi)皮祖細(xì)胞完全培養(yǎng)
 
基（產(chǎn)品編號(hào)：TBD20180052）以 1.5-3×10⁶ 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于一次
 
性細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
 
（2）2-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱為單核細(xì)胞）。
 
（3）10-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。
 
（4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞。
 
注：
 

• 無(wú)血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8%經(jīng)篩選的胎牛血清。

 

• 完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）。

 

• 由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡(jiǎn)單的純化目的，此法成

 

本相對(duì)較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽(yáng)性或陰
 
性分選。
 
【注意事項(xiàng)】
 

• 全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最好在取樣 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣品存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差。樣品放置超過(guò) 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

 

• 本實(shí)驗(yàn)最好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。

 

• 吸取過(guò)多的目的細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。

 

• 分離液用量大于骨髓單細(xì)胞懸液樣本時(shí)，分離效果更佳。

 

• 如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過(guò)低，請(qǐng)聯(lián)系技術(shù)支持以尋求幫助。

 
【儲(chǔ)存條件及有效期】
 
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟
 
封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
 
【參考值（參考范圍）】
 
本實(shí)驗(yàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞提取率大于 80%。
 
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。
 

	紅細(xì)胞		白細(xì)胞		血小板
		（4.0-10.0）×109
含量（個(gè)/L）	（4.0-5.5）×1012	中性粒細(xì)胞	淋巴細(xì)胞	單核細(xì)胞	（1.0-3.0）×1011
		50%-70%	20%-40%	3%-8%
【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】

 

• 骨髓沖洗單細(xì)胞懸液制備技術(shù)。

 

• 所獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。

 

• 所獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。

 

• 所獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)