四環(huán)素快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物四環(huán)素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗四環(huán)素抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物四環(huán)素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物四環(huán)素的含量。
二、試劑盒特性
u 試劑盒靈敏度：  0.05ppb
u 孵育溫度：      25℃
u 孵育時(shí)間：      30min～15min
u 樣本檢測下限
雞肉樣本：
四環(huán)素 ···········································  0.4ppb
二甲胺四環(huán)素 ··································  0.4ppb
吡四環(huán)素 ········································  0.4ppb
金霉素   ········································  0.4ppb
脫甲基金霉素 ·································  1.2ppb
土霉素 ··········································  0.8ppb
強(qiáng)力霉素 ·······································   1ppb
豬肉、蜂蜜樣本：
四環(huán)素 ··········································  0.5ppb
二甲胺四環(huán)素 ·································  0.5ppb
吡四環(huán)素 ······································   0.5ppb
金霉素 ·········································   0.5ppb
脫甲基金霉素 ································   1.5ppb
土霉素 ···········································   1ppb
強(qiáng)力霉素 ········································  1.2ppb
u 交叉反應(yīng)率
四環(huán)素 ··········································  100%
二甲胺四環(huán)素 ·································  125%
吡四環(huán)素  ·······································   110%
金霉素  ···········································  100%
脫甲基金霉素 ···································   35%
土霉素  ············································  58%
強(qiáng)力霉素  ·········································  45%
u 樣本回收率
雞肉、豬肉、蜂蜜 ····························  85±20%
三、試劑盒組成

1	微量測試孔	每條8孔，一板12條
2	標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液（81ppb）	1ml	黑色帽
3	高濃度標(biāo)準(zhǔn)品（100ppb）	1ml	黑色帽
4	酶標(biāo)記物	7ml	白色帽
5	抗體工作液	7ml	白色帽
6	底物A液	7ml	白色帽
7	底物B液	7ml	黑色帽
8	終止液	7ml	黃色帽
9	20X濃縮洗滌液	15ml	白色帽
10	10X樣本提取液	50ml*2	透明帽
11	標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液	15ml*2	藍(lán)色帽

四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）、恒溫箱
微量移液器：單道 20～200μl、單道100～1000μl、多道 30～300 μl
試      劑：甲醇
五、樣本前處理步驟
u 樣本處理前須知
（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。
（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
u 樣本前處理需配制：
配液1  樣本提取液A
用去離子水450ml與50ml 10X樣本提取液混勻或按9：1的比例按需配制（如10X樣本提取液有結(jié)晶，需溶解后在進(jìn)行稀釋）。                                      
配液2  樣本提取液B
取甲醇50ml與450ml樣本提取液A混勻或按1：9的比例按需配制。
配液3  樣本提取液C
取甲醇100ml與270ml樣本提取液A混勻或按10：27的比例按需配制。
u 樣本處理：
（a）雞肉處理方法
1、 稱取1±0.05g均質(zhì)后的樣本于50ml離心管中，加入8ml樣本提取液A（見配液1），振蕩3min，室溫4000r/min以上，離心10min； 
2、 取50上清液用于分析
樣本稀釋倍數(shù): 8倍                         
（b）豬肉處理方法
1、稱取1±0.05g均質(zhì)后的樣本于50ml離心管中，加入10ml樣本提取液B（見配液2），振蕩3min，室溫4000r/min以上，離心10min； 
2、取50 μl上清液用于分析
樣本稀釋倍數(shù): 10倍                   
（c）蜂蜜處理方法
1、 稱取1±0.05g均質(zhì)后的樣本于50ml離心管中，加入10ml樣本提取液C（見配液3），振蕩3min，室溫4000r/min以上，離心10min； 
2、 取50 μl上清液用于分析
樣本稀釋倍數(shù): 10倍                        六、 酶標(biāo)免疫分析程序:
u 測定前應(yīng)須知：
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。
4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
u 操作步驟：
1、 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 配制標(biāo)準(zhǔn)品
標(biāo)準(zhǔn)品6：50μl標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液（81ppb）用950μl標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液稀釋    4.05ppb
標(biāo)準(zhǔn)品5：600μl標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液與300μl標(biāo)準(zhǔn)品6混合                1.35ppb
標(biāo)準(zhǔn)品4：600μl標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液與300μl標(biāo)準(zhǔn)品5混合                0.45ppb
標(biāo)準(zhǔn)品3：600μl標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液與300μl標(biāo)準(zhǔn)品4混合                0.15ppb
標(biāo)準(zhǔn)品2：600μl標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液與300μl標(biāo)準(zhǔn)品3混合                0.05ppb
標(biāo)準(zhǔn)品1：標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液         0ppb                                         
3、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
4、 配液：將15ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
5、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl/孔到各自的微孔中，然后加加入酶標(biāo)記物50μl/孔再加入抗體工作液50μl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
7、 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液250μl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
8、 顯色：加入底物A液50μl/孔，再加入底物B液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
9、 測定：加入終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含四環(huán)素量成負(fù)相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.05ppb為1.816；0.15ppb為1.415；0.45ppb為0.74；1.35ppb為0.313；4.05ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是1.35ppb～4.05ppb；樣本2的濃度范圍是0.15ppb～0.45ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中四環(huán)素實(shí)際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光率（%）＝	B	×100%
	B0

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中四環(huán)素實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）
八、 注意事項(xiàng)
1、 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質(zhì)期
1、 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
2、 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請放心使用。
 
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